確認新目標基因功能的新技術 
 
生物科技 第14期(2003)
作者: Shannon Simons /Genetic Engineering News, Volume 23
譯者: 許銘仁
前言:隨著基因分析所提供的大量和疾病相關之新基因標的物資訊,這基因標的物的價值功能評估便成為一個提升新藥開發效率的關鍵之一,許多公司都在找尋可以快速且有效率地將基因上的新發現轉變成新產品的方法。

找尋正確的目標基因且進行更多研究
隨著基因分析所提供的大量和疾病相關之新基因標的物資訊,這基因標的物的價值功能評估便成為一個提升新藥開發效率的關鍵之一,許多公司都在找尋可以快速且有效率地將基因上的新發現轉變成新產品的方法,在新藥開發的初期,判定新目標基因的市場價值是相當重要的,同時也必須做出正確的決定來針對特定基因進行新藥開發。

在惠氏藥廠中,目標基因的價值評估意味著提供表現在相關組織和特定細胞中和疾病相關的基因資訊,且調控這些基因標的物的活性可以在細胞培養和動物模式中證實改善特定疾病的性狀。惠氏藥廠大都自行進行疾病基因標的物的價值評估,不論是在核心研究團隊如基因分析部門或是在藥物治療的領域。

惠氏藥廠基因分析部門主管Charles Richard 三世表示:「我們利用許多不同的方法進行基因功能上的效用評估,但是目前最主要的工具還是在細胞培養模式中利用RNA干擾 (RNAi)、阻斷基因表現的方法(如果可能的話)或是利用基因工程將老鼠體內的特定基因過度表現或是阻斷其表現來評估,這些疾病相關基因功能效用評估實驗的結果將被用來確定基因標的物的市場價值優先次序,並且藉著初期大量篩選的結果來決定是否針對某特定基因進行新藥開發與否。」

在技術上主要的挑戰在於如何研發並利用機械性的方法在細胞培養系統中進行基因功能效用評估。Antisense (反向) DNA和一些核酸酵素(ribozymes)的使用已經很難獲得可信賴的結果,因此RNA干擾的技術已經迅速成為在細胞培養或是動物模式中阻斷特定基因RNA表現的新選擇。

雖然RNA干擾的技術已在許多實驗室成功的運作,但是仍有部分技術上的挑戰仍待克服,這些挑戰包括作用位置選擇的區分和建立可引導性的基因表現系統來調控RNA干擾試劑在更多種不同的細胞型式和系統中作用。除此之外,Richard博士也表示,將RNA干擾實驗的結果和其他疾病相關基因標的物效用分析的方法如對偶基因變異、抑制性月生肽或者中和性的抗體的使用相比較是有益的,且和其他使用小分子抑制劑的結果比較也可進一步確認RNA干擾技術足以應用在基因效能分析上。

人類基因資訊取得的進展和如DNA陣列分析方法的發展都使得我們可以更容易取得大量可供功能效用分析的疾病相關基因資訊。供基因功能效用分析的方法迄今仍無法維持一定步調的進展並導致瓶頸的出現。而RNA干擾的技術則提供了一個較高效率的基因功能分析方式來快速且有效率的在短時間內測試較多數量的疾病相關標的基因並突破此瓶頸。利用這些方法再加上完整的基因圖譜序列分析將有助於建立一系列和特定基因家族或是和廣泛基因相關的RNA干擾試劑。Richard 博士認為,接下來的挑戰將包括了確定這些試劑是否在實際狀況下確實有能力減少目標基因mRMA或是蛋白質的表現(如果要同一時間分析成百上千個基因將較只分析一個來得困難許多),以及在相關的細胞實驗模式中,能否將這些試劑有效率地運送到其作用位置。

eXpress Profiling(XP)
Althea公司(聖地牙哥)使用表現大量基因的方法eXpress Profiling(XP)來進行疾病相關基因效能的研究分析,這個技術平台提供研究人員分析目標基因和特定疾病間的相關性。Joseph Monforte博士表示,針對特定疾病,應用XP於研究中將可提供大量和此疾病相關基因的效能分析的資訊。XP分析方法被設計來監測在特定疾病訊息路徑中基因表現的變化,並且利用這方法分析所得到的結果可提供我們一些特定疾病和多種不同基因表現的相關性。Monforte博士也認為,細胞是極複雜的系統,大多數的時間,當我們阻斷某疾病路徑但我們仍然可以偵測到此路徑活性時,我們可以思考這將是值得我們去探索發現的一個很好標的。如果可以了解引起某種疾病所牽涉到的特定基因改變將可以減少花費時間在尋找並排除多數不相關的基因資訊,且可將大部分資源投入在這最具價值的藥物作用標的研發上。分析和疾病相關不同基因間的整個交互作用網絡較之前針對單一訊息路徑的傳統方法似乎較具優勢,利用XP分析,可以取得導致某種疾病發生所引起不同基因間變化的動態資訊,所以我們不僅可以從中得知和疾病相關聯的基因為何,除此之外,我們也可以明白疾病產生過程中欲測基因標的和其他相關連基因間的交互作用。Monforte博士說到”我們的顧客大部分的時間都想在其所取得的多數疾病相關基因資訊中釐清任一單一基因是否真正參與其中或其在疾病中所扮演的角色為何,”這個方法的目的即在於允許研究人員在所獲得的特定基因資訊中作出更精確且更低市場風險的選擇來進一步進行新藥開發的工作。

DS GeneAtlas
隨著研究花費的不斷增加和專利的到期,如何快速發展更多的新藥並投入市場獲利已成為近來各藥廠當前重要課題坐@。而Accelrys公司在這領域可以提供的,無論是透過研發部門的合約性合作計畫或是直接提供客戶技術轉移,都可以協助了解在序列或是結構為基礎的層級上某特定疾病相關標的基因的生化功能。Accelrys的電腦生物部部長David J. Edwards也表示可以應用的專一性產品包括了Discovery Studio (DS)基因資料庫,DS SeqStore和可以應用於生物資訊序列分析的GCG Wisconsin package,除此之外,DS GeneAtlas,DS Modeling,Insight II 和QUANTA 也可以透過同質性模式、X 光繞射或NMR結構分析來進行蛋白質3D立體結構的研究。Edwards博士表示,Accelrys的顧客通常在找尋一個可以分析疾病相關標的基因生化功能的工作模式和標的蛋白中主要和其功能相關的結構為何的資訊,而這些資訊將可以提供他們一些何種小分子可能鍵結至標的基因的線索,進而協助他們訂定且選擇針對特定目標基因的初步篩選之化合物資料庫。DS GeneAtlas 是一個高效率的自動化軟體環境被設計來提供預測一個新發現目標基因的假想功能,並可以藉由此軟體分析目標基因序列來預測此序列轉譯而成的蛋白之功能,經由這些資訊,將有助於發現新的治療先驅物。Edwards博士認為DS GeneAtlas 也代表Accelry在發掘新疾病相關目標基因工作上的一個創新,它為生物學家帶來了他們所需要的3D生化資訊(例如預測蛋白序列可能形成的結構及功能)。DS GeneAtlas的重要性在於它可以顯示一般生物資訊序列分析所不能提供的訊息,因此可以給予實驗室中的科學家一個重要的開端來設計接續的實驗以確認標的蛋白的功能及其和疾病的相關性。

ssDNA Expression System
CytoGenix公司(休士頓)的細胞內單股DNA(ssDNA)表現系統已被證實可以有效負向調控目標基因的表現,CytoGenix研發部門負責人Yin Chen博士表示「我們的單股DNA表現技術是被設計來進行高效率且專一性地抑制細胞內特定蛋白表現,這技術抑制了細胞內轉錄、轉譯甚至轉譯後蛋白的功能。」陳博士舉例說明,「在我們對於泡疹病毒的研究中發現,我們可以藉由表現競爭性或是假目標(decoy)的 DNA序列來抑制和病毒複製相關的早期轉錄因子表現,進而達到有效減少病毒數目的最終目標。我們在大學的合作夥伴之一也已經利用反向DNA(Antisense DNA)成功地以超過95%的程度抑制膀胱癌細胞增生所需的一個蛋白(pkca)的表現。」

CytoGenix的反向DNA表現技術包括了將質體DNA送入細胞並生產複製特定的單股DNA。這個單股DNA會鍵結至mRNA上並防止核醣體(ribosome)轉譯mRNA而終止轉錄蛋白的進行。另外,這公司的催化性DNA技術利用CytoGenix質體DNA進入細胞並複製單股DNA,接著這單股DNA便會和mRNA雜交而酵素性的使得 mRNA斷裂,因此防止並中斷mRNA轉錄成蛋白。「Target Validation」代表許多不同意義,CytoGenix公司則將其解釋為利用偵測和阻斷基因表現來驗證基因的功能。一般而言,CytoGenix公司的顧客都在尋找一種經由有效的基因表現阻斷技術確認過的表現型。「我們可以根據客戶所提供一段特定的mRNA序列,在預測二級結構的基礎下,來設計催化性的對應DNA序列。接著便在無細胞或是完整細胞系統下測試這設計出來的DNA序列。最後利用標準方法來偵測基因的表現,無論是在mRNA或是蛋白的層級。」陳博士解釋。

Knockdown Tools
Atugen公司(柏林)提供三種基因阻斷的工具:antisense (GeneBloc)、合成性RNA干擾分子、和核酸酵素。研究部門負責人Klaus Giese博士說:「我們的技術平台包含一套多種使基因不表現的工具,這些工具分別透過不同的作用機制來阻斷同一基因表現。因此,經由這些不同工具作用而分別得到的類似結果將可以使得所觀察的表現型更真實反應臨床上的真實情況。」

這些使基因不表現的工具可以在體內或體外使用來破壞特定的目標mRNA並造成表現型的改變,這些表現型的變化可以在不同的生化層級觀察,當測定mRNA阻斷是否和蛋白表現被抑制有相關時,同時也利用一些細胞層級的分析方法或是人類疾病的動物模式來鑑定特定基因功能的喪失與否。Giese博士表示:「我們可以藉著運用我們的細胞轉殖試劑系列產品來調整實驗條件,使得基因不表現分子更容易送到特定的細胞株內,而可針對客戶的不同需求提供技術服務,亦即我們並不侷限於特定的細胞種類,而且我們已成功的在特別困難進行轉殖的細胞,如T細胞中成功的完成轉殖。除了進行疾病相關目標基因的尋找及效用功能評估外,我們正應用這系列的基因不表現工具在一個稱作SignaLink的計畫中來鑑別疾病生成的訊息路徑。為了鑑定在癌症形成過程中所牽涉的基因為何,傳統方法主要是比較在單一時間點正常細胞和癌症細胞間的差別。因為癌症細胞染色體的不穩定性,使用這些傳統方法得到的結果通常會可觀察到數千個基因間有差異。相較之下,SignaLink則提供一種可以模擬疾病從起始表徵到逐步進展動態過程的新方法,舉例來說,失去抑制腫瘤細胞生長的功能來觀察腫瘤的形成,這樣可以在疾病生成的各個步驟中來鑑定參與其中的基因,無論是在RNA或是蛋白質層級,這將讓我們在整個的疾病進行過程中可以發現到早期的分子變化。」根據Giese博士〞k,「這些發現到的新疾病相關基因接著將藉由以細胞為基礎的實驗系統或是動物模式中來確認是否具有功能,在此,我們也同時應用可誘導的siRNA或是核酸酵素表現系統,這些將有助於我們在疾病進行過程中,研究不同時間點的基因功能變化,Atugen已經在老鼠模式中使用可誘導性的表現系統來判斷新的致癌基因目標是否具有功能。」「我們已經發展出合成性且穩定的siRNA,可以在體內進行致病基因的分析甚至有可能應用於治療上,這些siRNA分子都可以抵抗核酸分解酵素,因此可以避免在體內進行分析時面臨siRNA分子穩定性的問題。透過這些研究,我們將可以學習到更多在癌症生長及轉移時,特定基因所扮演的角色。」

) RNA Lasso
SomaGenics公司(Santa Cruz, CA)專精於以RNA為基礎的基因抑制劑生產,Soma Genics的總裁Brian Johnston表示「SomaGenics可以針對任何感興趣的基因生產基因抑制劑,Soma Genics也可以針對客戶需求有興趣的細胞株提供適當的實驗步驟計畫來將這些抑制劑運送到細胞內,如果消費者有興趣使用Soma Genics的抑制劑當作治療藥物,我們也有技術轉移或是共同合作研發這些分子的計畫。」這個公司領先的技術之一為RNA 套索(Lassos),RNA 套索可以先和目標mRNA形成雙股螺旋結構,接著連結套索的尾端,便和目標RNA形成繩結或是超螺旋般的構造,這種作用模式包含了非常強的鍵結作用和單一核苷酸的高選擇性,和以往強的鍵結會導致低選擇性或是高選擇性卻需要較弱的鍵結能力明顯不同且較佳。舉例來說,位於一段含20核苷酸鏈上的單一的配對錯誤(mismatch)會防止RNA 套索的鍵結,純化的RNA可以像DNA載體一樣被運送至細胞內且被認為具有很低甚至不具細胞毒性,這將有助於長期或是小分子在標的組織中調控RNA 套索的表現。現今大多數的反向DNA方法只具有些微的效力,這也正是我們面臨的挑戰之一,而RNA干擾技術的出現,將有助於我們克服這難題。Johnston博士表示,「許多公司在尋找一個技術或是有經驗的研究人員來滿足他們對於尋找特定疾病相關基因的需求,同時也須對客戶的特定需求兼具彈性及有所回應。除了設計特定的抑制劑,SomaGenics也正發展以資料庫為基礎的方法,可以根據表現型來選擇特定的基因抑制劑,甚至是在目標基因還未知的時候。」不像RNA干擾技術或是其他大多數的反向DNA方法,RNA 套索並不會破壞作用標的mRNA,而是簡單的阻斷轉譯或是蛋白質的結合。和之後的舉例類似,利用特定的插入序列(intron)來阻斷移接(splicing)的訊息,RNA 套索似乎是具潛力的理想試劑來影響特定移接片段的改變。

Johnston博士表示既然接近半數的人類基因的移接形式都不相同,且這些不相同的基因移接片段相互間的功能也相差甚鉅,如果可以在不去活化標的基因情況下來改變基因移接形式,這將是在治療或是基因分析應用上非常有力的工具。已經接受將近20個美國政府的合約的SomaGenics最近接受NIH的計畫,就像應用在基因移接的調控,而將其技術應用在研究多重性硬化症及C型肝炎的治療上。

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