離子交換層析法 Ion exchange chromatography

一、基本原理

 

離子交換層析法 ion exchange chromatography,簡稱IEC)是從複雜的混合物中,分離性質相似大分子的方法之一,依據的原理是物質的酸鹼性、極性,也就是所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質,對管柱上的離子交換劑有不同的親和力,改變沖洗液的離子強度和pH值,物質就能依次從層析柱中分離出來。

 

離子交換層析法大致分為5個步驟:

1.      離子擴散到樹脂表面。

2.      離子通過樹脂擴散到交換位置。

3.      在交換位置進行離子交換;被交換的分子所帶電荷愈多,它與樹脂的結合愈緊密,也就愈不容易被其它離子取代。

4.      被交換的離子擴散到樹脂表面。

5.      沖洗液通過,被交換的離子擴散到外部溶液中。

 

離子交換樹脂的交換反應是可逆的,遵循化學平衡的規律,定量的混合物通過管柱時,離子不斷被交換,濃度逐漸降低,幾乎全部都能被吸附在樹脂上;在沖洗的過程中,由於連續添加新的交換溶液,所以會朝正反應方向移動,因而可以把樹脂上的離子沖洗下來。

 

如果被純化的物質是氨基酸類的分子,則分子上的淨電荷取決於氨基酸的等電點和溶液的pH值,所以當溶液的pH 值較低,氨基酸分子帶正電荷,它將結合到強酸性的陽離子交換樹脂上;隨著通過的緩衝液pH逐漸增加,氨基酸將逐漸失去正電荷,結合力減弱,最後被洗下來。由於不同的氨基酸等電點不同,這些氨基酸將依次被洗出,最先被洗出的是酸性氨基酸,如apartic acidglutamic acid(在約pH3~4時),隨後是中性氨基酸,如glycinealanine。鹼性氨基酸如argininelysinepH值很高的緩衝液中仍帶有正電荷,因此這些在約pH值高達10~11時才出現。

 

 

 

 

二、樹脂材質

 

最常見的離子交換樹脂材質是聚苯乙烯-苯二乙烯(polystyrenedivinylbenzene),它是由苯乙烯(styrene)和苯二乙烯(divinylbenzene)聚合產生的三維網狀結構,舉例來說,Dow化學公司所生產的樹脂Dowex 50×8,表示含8%苯二乙烯。

 

根據交換樹脂的性能,分為陽離子與陰離子交換樹脂。

 

1.      陽離子交換樹脂

 

分為強酸型、中強酸型和弱酸型三類,強酸型樹脂含有-RSO3H,中強酸型樹脂含有-PO3H2、-PO2H2或-OPO2H2,弱酸型樹脂含有-COOH或-OH 陽離子交換樹脂進行的反應如下:

 

 

 

 

2.      陰離子交換樹脂

 

分為強鹼型、中強鹼型和弱鹼型三類,含有銨鹽,四級銨鹽 [ N+(CH3)3] 為強鹼型樹脂,三級以下銨鹽 [N(CH3)2][ NHCH3][ NH2] 都屬弱鹼型樹脂;同時具有強鹼和弱鹼型基團的,為中強鹼型的樹脂。陰離子交換樹脂進行的反應如下:

 

 

 

除了樹脂以外,纖維素(cellulose)、葡聚糖凝膠(Sephadex gel)和瓊脂糖凝膠(Sepharose)也是常用的離子交換材質,特性是具有親水性和較大的表面積,對生物活性物質而言,是一個較為溫和的環境,同時也是大分子所適用的分離純化材質  。常用的種類如下:

 

 

 

實驗證明,纖維材質對蛋白質和核酸的分離純化效果相當好,因為離子交換纖維的種類多,能依據不同分離目的使用,且功能團基主要在表面,對生物大分子的交換十分有利。

 

 

 

三、離子交換劑的選擇

 

離子交換劑的選擇,首重保持欲分離物質的生物活性,以及在不同pH值環境中,此物質所帶的電荷和電性強弱。

 

1.      陰陽離子交換劑的選擇

 

若被分離物質帶正電荷,例如polymyxin cytochrome C這些鹼性蛋白質,它們在酸性溶液中較穩定,親和力強,故採用陽離子交換劑;其它像heparinnucleic acid這類酸性物質,在鹼性溶液中較穩定,則使用陰離子交換劑;如果欲分離的物質是兩性離子,一般考慮在它穩定的pH範圍帶有何種電荷,作為交換劑的選擇。以胰島素(insulin)為例,它的等電點為pH 5.3,因此在pH<5.3(酸性)溶液中,採用陽離子交換劑,在pH>5.3的鹼性溶液中,使用陰離子交換劑。

 

簡言之,已知等電點的物質,在高於等電點的pH條件下,因帶有負電荷,應採用陰離子交換,在低於等電點的pH下,則採用陽離子交換。未知等電點的物質,在一定pH條件下進行電泳,向陽極移動較快的物質,在同樣條件下可被陰離子交換劑吸附,向陰極移動較快的物質可被陽離子交換劑吸附。

 

2.      緩衝液的選擇

 

緩衝液酸鹼度的選擇,決定於被分離物質的等電點、穩定性、溶解度和交換劑離子的pK值。使用陰離子交換纖維時要選用低於pK值的緩衝液,若欲分離的物質屬於酸性,則緩衝液的pH值要高於該物的等電點;用陽離子交換纖維時要選用高於 pK值的緩衝液,目的物屬於鹼性物質的話,緩衝液要低於該物等電點的pH值。

 

緩衝液離子以不干擾分離物活性測定、不影響待測物溶解度、不發生沉澱為原則,如使用UV吸收法測樣品,那麼pyridinebarbital這類會吸收UV的物質就不適用。

 

 

四、離子交換樹脂的前處理

 

離子交換樹脂使用前,先以蒸餾水除去其內之雜質 ,並以NaOHHCl處理樹脂,使其上的官能基完全露出。陰離子交換樹脂先以15倍於樹脂量的0.5 N HCl 浸泡30~120分鐘,再以水清洗至pH 7.0,之後用0.5 N NaOH浸泡30~120分鐘,同樣以水清洗至pH 7.0,最後用欲使用的緩衝液浸泡。陽離子交換樹脂用15倍於樹脂量的0.5 N NaOH浸泡30~120分鐘,以水清洗至pH 7.0,之後用0.5 N HCl 浸泡30~120分鐘,再以水清洗至pH 7.0,最後用欲使用的緩衝液浸泡。

 

 

 

 

 

 

※參考資料: 李建武等合編   生物化學實驗原理和方法  P59~75     藝軒圖書出版社  (1999)

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